病毒RNA提取純化試劑的常規(guī)實驗操作

實驗操作：

1.如果有N個樣品，標記N+2個1.5-2mL螺旋蓋塑料離心管，多出的一個為陽性對照，一個為陰性對照。為避免污染，建議不要使用壓蓋式塑料離心管。在每個管上做個標記，以在后續(xù)操作時區(qū)別向心面和離心面。

2.在離心管中分別加入0.2mL液體樣品（血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、眼淚等等），陽性對照和陰性對照。

如果是口腔拭子、咽喉拭子等各種拭子樣品，則將拭子放入0.2mL自備生理鹽水中擠壓出液體，然后取0.2mL進行提取。

如果是糞便等半固定樣品，則取約0.3mL的樣品，加入0.3自備生理鹽水，震蕩重懸，離心取0.2mL上清進行提取。

如果血液，細胞培養(yǎng)液等含細胞的液體，可以離心用上清，也可以直接取用，但后者提取的RNA中有細胞的基因組DNA污染。血漿的抗凝劑必須是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD時由于所加入ACD會增加體積，樣品會被稀釋，得到的病毒滴度會比使用 EDTA低15%左右。血漿按0.6mL/管的量分裝保存，以避免反復凍融。

如果樣品是實體組織或培養(yǎng)細胞，則需要在自備生理鹽水中勻漿后離心，用0.2mL上清液（含病毒）進行提取，但此種情況下后得到的RNA不可避免的會含有基因組DNA 污染。

如果液體樣品中的病毒需要富集，可以使用1.5mL上述方法得到的液體在4℃24000g 冷凍離心60分鐘，移棄1.3mL、用剩下的0.2mL繼續(xù)操作。

3.在每個離心管中加入0.6mL RNA病毒裂解液。RNA病毒裂解液在低溫放置會產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，需提前65℃水浴溶解并充分搖勻后取用。

4.室溫放置10分鐘裂解病毒。

5.振蕩數(shù)秒后加入0.7mL室溫異丙醇，旋緊蓋后振蕩30秒混勻，把離心管的向心面對向轉(zhuǎn)頭的中央，13000-15000g室溫離心至少15分鐘。

6.小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀（此時可能看不見）。

7.加入1.0mL室溫70%乙醇，振蕩數(shù)秒后15000g室溫離心5分鐘。注意：在離心機中放置離心管時將其向心面對向轉(zhuǎn)頭的中央。

8.小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀（此時呈膜狀沉淀）。

9.再短暫離心數(shù)秒，用移液器移棄殘留液體（70%乙醇），否則它會影響后續(xù)反應。

10.加入200μl RNase-free水或1×液相RNase Erasol(能滅活殘留的RNase，而 RNase-free水無此功能)，用移液槍仔細吹打離心管管底和管壁離心面的膜狀RNA沉淀，溶液將呈混濁狀，含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有RNA，所以不要離心后取上清使用，必須取混合液使用，哪怕很渾濁。

11.直接取適量用于RT-PCR，如果溶于200uL水，同時樣品使用量不超過RT-PCR體系的 1/2，不溶物一般不會影響RT-PCR。剩余樣品可以室溫放置2小時，也可保存于-80℃保存一個月。