豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒的操作方法

1.取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動，不要吸到上層保護液)，用力顛倒10次混勻，12,000rpm離心10min。

2.取500µL上清置于滅菌離心管中，加入500µL異丙醇，混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管，室溫融化，13,000rpm離心15min。

3.棄上清，沿管壁緩緩加入1mL洗滌液，輕輕旋轉一周后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。

4.用30µL無菌水溶解沉淀，作為模板備用。

樣品制備：

1.樣品采集：病死或撲殺的豬，取大腦海馬背側皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融。)

2.樣品處理：

2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物；然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。

2.2全血樣品的處理：待血凝后取血清放于離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。

2.3陽性對照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。

2.4陰性對照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。

PCR：

1.反應體系：分別取16µLPCR反應液A(用前混勻)、2µLPCR反應液B(用前混勻)和2µL模板DNA，混勻。

2.反應程序：在PCR儀上運行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35個循環；72℃延伸10min。

電泳：

1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。

2.電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴增產物點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。

3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結果。