技術(shù)講堂—抗體的選擇（2）

一、一抗選擇需要確定或參考的信息

（一）目的蛋白的信息

確定想檢測(cè)的目的蛋白是否與抗體識(shí)別蛋白信息吻合，注意中英文名字、別名等信息。

某些蛋白具有多種不同的亞型，這需要在選擇抗體之前確定要研究的蛋白亞型。還有些抗體由于其抗原選擇的是不同蛋白亞型共有的肽段區(qū)域，是可以同時(shí)識(shí)別多個(gè)亞型的。有的蛋白通過(guò)剪切加工才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓幕钚孕问剑鏑aspase、Insulin等，這就需要根據(jù)研究需要，選擇針對(duì)前體或成熟形式的特異性抗體。

（二）抗體制備所用抗原的信息

抗體是由各種不同抗原免疫宿主而制備得來(lái)，抗原類型包括：全長(zhǎng)蛋白、蛋白片段、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說(shuō)明書一般都有制備抗體所用抗原的描述。在有些情況下，需要查閱抗體制備相關(guān)抗原信息來(lái)選擇抗體。比如，針對(duì)重組表達(dá)蛋白選擇抗體，如果是表達(dá)部分蛋白片段，則需要注意抗體的抗原區(qū)域是否在該片段區(qū)域內(nèi)。某些特殊蛋白（如病原體蛋白）未經(jīng)過(guò)內(nèi)部驗(yàn)證種屬的目的蛋白，需要求助生產(chǎn)商進(jìn)行蛋白同源性序列比對(duì)，并結(jié)合制備抗體所用的抗原序列，查看交叉反應(yīng)的情況。

（三）修飾位點(diǎn)的信息

在選擇合適的抗體用于特定修飾位點(diǎn)研究時(shí)，需要特別注意，不同位點(diǎn)的修飾可能有不同的機(jī)制存在，不宜一概而論。有關(guān)不同修飾位點(diǎn)的功能，可以通過(guò)查閱文獻(xiàn)確定。另外，由于有的蛋白存在不同亞型且序列高度同源，而不同亞型的某些磷酸化修飾位點(diǎn)周圍的序列*相同，因此針對(duì)這些保守的修飾位點(diǎn)的抗體往往會(huì)同時(shí)識(shí)別不同亞型的相似修飾位點(diǎn)。

（四）實(shí)驗(yàn)樣本的種屬信息

抗體一般會(huì)在出廠前對(duì)常見的不同種屬目標(biāo)樣本進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，以確定可以滿足的不同種屬類型，可以在產(chǎn)品說(shuō)明書的Species-Reactivity一欄中看到（如人、小鼠、大鼠等）。通過(guò)驗(yàn)證，達(dá)到質(zhì)檢要求的種屬會(huì)明確標(biāo)記，以備參考。沒有做過(guò)關(guān)于這些種屬的實(shí)驗(yàn)，所以不建議使用。一些沒有標(biāo)明的種屬，也有可能是可以應(yīng)用的，建議通過(guò)聯(lián)系抗體公司技術(shù)支持來(lái)獲得相關(guān)抗原序列比對(duì)的信息，根據(jù)蛋白同源性的情況以確定是否可以用于該種屬的樣本。為了避免實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，盡量不要使用說(shuō)明書中沒有提及的標(biāo)本的種屬的抗體。

（五）抗體應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)類型

抗體一般會(huì)在出廠前對(duì)常見的抗體應(yīng)用(WB、IP、ChIP、IHC、IF、FCM)進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，以確定是否可以滿足不同應(yīng)用要求。通過(guò)驗(yàn)證，達(dá)到質(zhì)檢要求的抗體會(huì)明確標(biāo)記，以備參考。一些沒有標(biāo)明的應(yīng)用，往往是因?yàn)榻?jīng)過(guò)驗(yàn)證沒有達(dá)到質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)而不推薦，千萬(wàn)不要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或常識(shí)去推測(cè)某個(gè)抗體的應(yīng)用。比如，有的客戶會(huì)認(rèn)為，既然某個(gè)抗體可以用于IHC，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)推斷應(yīng)該可以用于IF，但畢竟這是不同的兩個(gè)應(yīng)用，這樣做可能會(huì)浪費(fèi)很多時(shí)間和試劑而不能獲得結(jié)果。抗體廠家不推薦您使用沒有標(biāo)明的應(yīng)用，可以挑選其他的貨號(hào)，可能有適用于這個(gè)應(yīng)用的更好的其它產(chǎn)品。如果抗體說(shuō)明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種應(yīng)用類型，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種應(yīng)用的內(nèi)部驗(yàn)證。為了避免實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)說(shuō)明書中沒有提及的應(yīng)用方法時(shí)，可向生產(chǎn)商申請(qǐng)?jiān)囉醚b，進(jìn)行初步預(yù)實(shí)驗(yàn)后，再?zèng)Q定是否購(gòu)買。

（六）標(biāo)記物的信息

有一些實(shí)驗(yàn)，如多重免疫熒光、多指標(biāo)流式測(cè)定可能會(huì)使用到直接標(biāo)記的一抗（簡(jiǎn)稱直標(biāo)一抗）。在進(jìn)行直標(biāo)一抗選擇時(shí)，需要了解到自己將要使用的儀器能檢測(cè)到的熒光范圍，針對(duì)不同的參數(shù)要求選擇合適的標(biāo)記物。在設(shè)計(jì)多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮每種熒光基團(tuán)的*性質(zhì)，如大吸收波長(zhǎng)和大發(fā)射波長(zhǎng)，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。有關(guān)標(biāo)記物選擇的細(xì)節(jié)，我們將在后面的免疫熒光與流式技術(shù)部分詳加介紹。

二抗選擇需要確定或參考的信息

（一）一抗的來(lái)源種屬

主要根據(jù)一抗來(lái)源種屬而決定二抗來(lái)源，如一抗是小鼠來(lái)源，那二抗就買抗小鼠的即可。

（二）二抗應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)類型

針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，需要考慮二抗所偶聯(lián)的標(biāo)記物，如HRP、Biotin、熒光素等標(biāo)記物。WB與IHC所用的二抗，所帶的標(biāo)記物主要選擇HRP和Biotin，而免疫熒光和流式應(yīng)用可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，選擇不同熒光素標(biāo)記的二抗，如FITC、Cy3、PE等。